| Sažetak | The emergence of resistance (pest resistance to control measures) is a serious and growing problem in agricultural production that significantly reduces yields. Without effective control, 70% of food for human and livestock consumption is wasted. The western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) (WCR), Codling moth (Cydia pomonella L.) (CM), and Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) (CPB) are the most important pests in Croatian agriculture, and these insects have developed resistance to various insecticides and established control strategies. There is a need to find effective methods for determining resistance that will allow early detection and the development and timely implementation of resistance control strategies.
In this study, two methods were used. The first was single nucleotide polymorphism (SNP) markers which were used to perform detailed population genetic analysis of the whole genome of the insects investigated. The second was geometric morphometric (GM) methods to analyze morphological variations related to resistance development. The aim of this dissertation was to analyze population genetic structure, differentiation, gene flow, distribution and adaptability of the three target insect pests by genotyping SNPs. In addition, morphometric analyzes were performed to examine phenotypic variation across populations investigated in Croatia.
For genetic analyzes, genomic DNA of WCR, CM and CPB was isolated and genotyped and the forewings (CM) or hindwing (WCR and CPB) size and shape difference were investigated for morphometric analyses. The data generated were analyzed using the statistical program R. The approaches used to analyze the genetic structure of WCR, CM and CPB populations inclluded: Bayesian-based models of population structure (STRUCTURE), principal component analysis (PCA), discriminant analysis of principal components (DAPC), neighborhood cluster analysis (NJ), and VanRaden Kinship matrix analyzes. To confirm the genetic results, forewing and hindwing morphology was examined using geometric morphometric techniques based on the venation patterns of 14 landmarks for WCR, 18 landmarks for CM, and 16 landmarks for CPB.
The results for WCR indicated that the combination of genetic and geometric morphometrics could be a reliable technique to detect differences between WCR populations. The results also showed that geometric morphometrics can be used as a biomarker for resistance detection as part of a larger integrated resistance management strategy for WCR. For CM, SNP markers did not show sufficient power to detect changes between populations based on the type of apple control method from which they were sampled. However, geometric morphometrics showed higher sensitivity in detecting population changes associated with different types of apple production/control and proved to be a reliable, accurate, and cost-effective biomarker. For CPB populations, low genetic variability was found using SNPs and the presence of a single panmictic population in the study area was noted. The results of GM for the CPB populations demonstrated morphological changes across geographic space in Croatia thus demonstrating the phenotypic plasticity of CPB.
The combined use of SNPs and GM to detect resistant variants is a novel approach where morphological traits can provide additional information about underlying population genetics and morphology can contain useful information about genetic structure. Findings from this thesis also provided new insights into an important and timely area of pest management, namely in testing methods of early detection of resistance and novel use of monitoring methods. |
| Sažetak (hrvatski) | Pojava rezistentnosti na insekticide u kukaca ozbiljan je i rastući problem u poljoprivrednoj proizvodnji, koji može ugroziti učinkovito suzbijanje štetnika i zaštitu uzgajanih kultura. Uvođenje sintetskih insekticida za suzbijanje štetnih kukaca prije pedesetak godina izazvalo je veliki entuzijazam te se smatralo da su upravo oni održivo rješenje za sve probleme vezane uz proizvodnju i nestašicu hrane. Ipak, vrlo brzo pojavili su se problemi vezani uz negativne izravne i neizravne učinke na ljude i okoliš. Rezistentnost kukaca na diklor-difenil-trikloretan (DDT), nekada masovno primjenjivan sintetički insekticid, zabilježena je 1947. Od tada do danas utvrđena je rezistentnost brojnih štetnika na gotovo sve grupe insekticida na tržištu. Pojava rezistentnih populacija štetnika sve je veća, a time su povećani i gubitci u poljoprivrednoj proizvodnji. Iako se u svijetu koristi sve više insekticida, više od 500 vrsta kukaca, grinja i pauka razvilo je određenu razinu rezistentnosti. Nekoliko je načina razvoja rezistentnosti kukaca na insekticide: fiziološka, rezistentnost na mjestu djelovanja, morfološka i psihofizička rezistentnost. Bez obzira na tip rezistentnosti koju pojedini kukac razvija, ona proizlazi iz selekcije genetske modifikacije u jednome ili više gena koji se pojavljuju migracijom i/ili mutacijom.
Proizvodnja najvažnijih ratarskih (kukuruz i krumpir) i voćarskih (jabuka) kultura u Hrvatskoj ugrožena je brojnim štetnicima, od kojih su najznačajniji kukuruzna zlatica (Diabrotica virgifera virgifera LeConte – WCR), jabukin savijač (Cydia pomonella L. – CM) i krumpirova zlatica (Leptinotarsa decemlineata Say – CPB). Sve navedene vrste razvile su rezistentnost na insekticide i/ili strategije suzbijanja. Kukuruzna zlatica razvila je rezistentnost na 13 aktivnih tvari, ali ono što je još važnije, razvila je i otpornost na strategije suzbijanja (npr. plodored). Za jabukina savijača prijavljena su 196 slučaja rezistentnosti na 22 različite aktivne tvari. Krumpirova zlatica razvila je rezistentnost na čak 56 različitih aktivnih tvari te je službeno zabilježeno 306 slučajeva rezistentnosti diljem svijeta.
Pojavu i razvoj rezistentnosti moguće je spriječiti ili odgoditi pravovremenim djelovanjem, koje podrazumijeva monitoring pojave i ranog utvrđivanja rezistentnosti štetnika. Za monitoring i dokazivanje rezistentnosti uobičajeno se koriste metoda biotesta, biokemijski ili molekularni testovi, metode koje imaju određene prednosti, ali i nedostatke. Biotestovi često nisu dovoljno osjetljivi ili zahtijevaju velik broj živih kukaca (određivanje LD50) te ljudskoga rada dok biokemijske i molekularne metode nisu dostupne za sve tipove rezistentnosti ili zahtijevaju specijaliziranu i skupu opremu. Antirezistentni programi obuhvaćaju tri osnovne komponente: monitoring kompleksa štetnika u polju i promjena u gustoći populacije, ekonomski prag štetnosti i višestruke integrirane strategije suzbijanja štetnika. Otkrivanje i monitoring rezistentnih populacija prvi je korak prema implementaciji antirezistentnih strategija i održivoj uporabi insekticida. Antirezistentne strategije mogu osigurati dugoročnu učinkovitost pojedinih djelatnih tvari u suzbijanju štetnika.
Polimorfizam pojedinačnoga nukleotida (engl. Single Nucleotide Polymorphism – SNP) novija je metoda analize cijeloga genoma. Uporaba SNP-a mogla bi pomoći u boljem razumijevanju populacijske genetike kukuruzne i krumpirove zlatice te jabukina savijača. Takvi podaci koji podrazumijevaju utvrđivanje promjene genoma povezane s razvojem rezistentnosti ključni su za provedbu antirezistentnih programa kao sastavnoga dijela integrirane zaštite bilja od štetnika.
S obzirom na navedeno postavljene su hipoteze istraživanja: (1) Otpornost štetnika na insekticide rezultat je genetskih mutacija kukaca; (2) Mutacije se mogu učinkovito detektirati na
populacijskoj razini i dokazati u promjenama SNPs-a unutar i između populacija pojedine vrste štetnika.
Ciljevi istraživanja u sklopu doktorske disertacije bili su: (1) Uspostavljanje SNP genotipa za svaku jedinku u populaciji i SNP biblioteke za kukuruznu i krumpirovu zlaticu te jabukinog savijača; (2) Analizom ukupne genske varijabilnosti pomoću SNP-a odrediti razlike između i unutar populacija kukuruzne i krumpirove zlatice te jabukina savijača; (3) Utvrditi vezu između genetskih mutacija i rezistentnosti kukaca na insekticide.
Poznavanje evolucijskih promjena i ukupne genetske raznolikosti populacija nekoga štetnika može pružiti korisne informacije za razumijevanje genetskih uzoraka povezanih sa svakim stupnjem razvoja otpornosti štetnika, tako da se praćenje i suzbijanje mogu prilagoditi rezistentnosti pojedine vrste štetnika. Utjecaj okoline na genotip organizma kompleksan je proces za koji je potrebno puno više vremena da se utvrdi nego utjecaj okoline na fenotip organizma. Iz toga razloga istraživanja utjecaja okoliša, kao što su klima, biljni domaćin, strategije suzbijanja i dr., na populaciju i pojedine jedinke štetnika trebaju se temeljiti i na fenotipskim, a ne samo na genotipskim karakteristikama. Često štetnik postaje otporan na insekticid razvijajući fiziološke promjene, stoga smo u istraživanje uključili i tehnike geometrijske morfometrije kojima smo analizirali morfološke karakteristike oblika kukca koje su pod direktnim utjecajem promjene genotipa (npr. krila). Metoda geometrijske morfometrije ima veliku „statističku osjetljivost“, pa se njezinom primjenom mogu otkriti male promjene u obliku morfoloških cjelina (krila) zaduženih za širenje populacija.
Pokazalo se da su morfološke osobine, kao što su veličine i oblika krila kukaca, prvi fizički pokazatelji promjena jer su pod utjecajem okolišnih i genetskih čimbenika, što ih čini idealnim za otkrivanje i praćenje rezistentnih populacija štetnika. Osim uporabe geometrijske morfometrije kao alata za praćenje, ovom je metodom također moguće dobiti važne informacije o osnovnoj ekologiji kukaca. Točnije, oblik i veličina krila ili tijela mogu se koristiti kao markeri (biljezi) populacije i pomoću njih mogu se detektirati razlike između nerezistentnih i rezistentnih populacija.
Tijekom istraživanja prikupljene su: populacije kukuruzne zlatice iz Amerike, koje su razvile otpornost na plodored te na određene Bt toksine, populacije jabukina savijača prikupljene iz ekoloških i integriranih voćnjaka i populacije krumpirove zlatice iz najvažnijih uzgojnih područja krumpira u Hrvatskoj, kao i laboratorijske nerezistentne populacije kukuruzne zlatice i jabukina savijača. Ukupno je obrađeno više od 500 jedinki navedenih vrsta (100 jedinki kukuruzne zlatice te 200 jedinki krumpirove zlatice i jabukina savijača). Iz svake jedinke izolirana je cjelovita genomska DNK. Na uzorcima svake vrste provedena je genotipizacija korištenjem tehnologije nizova raznolikosti (DArT). Dobiveni podaci analizirani su u statističkome programu R. Za analizu genetske strukture populacija kukuruzne i krumpirove zlatice te jabukina savijača korišteni su različiti pristupi: Bayesov model strukturiranja (STRUCTURE), analiza glavnih komponenti (PCA), diskriminantna analiza glavnih komponenti (DAPC), analiza genetske udaljenosti (NJ) pomoću filogenetskoga stabla i VanRaden Kinship analiza. Kako bi se potvrdili genetski rezultati, metodama geometrijske morfometrije (GM) određene su morfološke varijacije unutar i između populacija. Za analize korišteni su biološki definirani markeri, koji se postavljaju na fotografije odabranih dijelova tijela kukca (markeri se postavljaju na gornja ili donja krila). Na svakome krilu odabire se određen broj homolognih markera (specifičnih točaka) tipa 1, definiranih na čvorištima ili završetcima vena. Na kukuruznoj zlatici određeno je 14 specifičnih točaka, na jabukinom savijaču 18, a na krumpirovoj zlatici 16. Dobiveni rezultati analizirani su standardnim programima i procedurama geometrijske morfometrije. Ukupno je analizirano 775 krila kukuruzne zlatice, 363 krila jabukina savijača i 258 lijevih krila krumpirove zlatice.
Genetskim analizama populacija kukuruzne zlatice utvrđena su tri genetička klastera (STRUCTURE), što je također potkrijepljeno VanRaden analizom i analizom genetske udaljenosti (NJ). Rezultati istraživanja pokazali su da su se populacije rezistentne na Bt toksin
Cry34/35Ab1 i kombinaciju toksina Cry3Bb1_Cry34/35Ab1 odvojile od ostalih populacija. Rezultati GM kukuruzne zlatice potvrdili su rezultate genetskih analiza. Rezultati istraživanja pokazali su da jedinke rezistentne na Cry3Bb1_Cry34/35Ab1 toksin imaju šira i veća krila, a varijacije su primijećene na markerima 9 (središnji dio) i 14 (gornji rub krila). Jedinke rezistentne na Cry3Bb1 toksin imaju uža krila dok jedinke rezistentne na Cry34/35Ab1 toksin imaju manja krila s varijacijama na točkama 3 i 4 (vrh krila). Izduženiji oblik krila imaju jedinke rezistentne na plodored te su uočene varijacije na točkama 1 i 2 (vrh krila), kao i proširenje udesno na točki 9. Ovaj rezultat posebno je važan jer pokazuje da različiti Bt toksini različito djeluju na promjene u obliku krila.
Populacije jabukina savijača STRUCTURE grupirao je u dva klastera, a rezultati PCA analize bili su u skladu s tim. DAPC je odvojio jedinke u tri različite skupine. Međutim, rezultati su pokazali da genetska varijabilnost između populacija iz organskih i integriranih voćnjaka nije značajna. Za populacije jabukina savijača rezultati istraživanja pokazali su da se populacije štetnika iz prirode (iz ekološkoga i integriranoga uzgoja) značajno razlikuju u morfologiji krila u odnosu na laboratorijsku populaciju, a varijacije su primijećene na pet točaka (1, 7, 8, 9 i 12). Kao posljedicu ovih varijacija populacije štetnika iz integriranoga i ekološkoga uzgoja imale su izduženija i proširenija krila u odnosu na laboratorijski uzgojenu populaciju, koja je imala ovalni oblik krila. Značajne razlike primijećene su i u morfologiji krila populacija iz integriranoga u odnosu na ekološki uzgoj, u kojem su GM rezultati pokazali veću osjetljivost od genetskih i razdvojili tri različite skupine.
Genetskim analizama populacijama krumpirove zlatice utvrđena je genetska struktura bez značajne varijabilnosti. Ustanovljena je jedna panmiktička populacija ili genetski klaster koji karakterizira populacije krumpirove zlatice u Hrvatskoj. Rezultati GM analiza populacije krumpirove zlatice omogućili su nam pronaći morfološke promjene povezane s geografskim područjima Hrvatske, potvrdili su malu razliku između populacija odnosno fenotipsku plastičnost ove vrste. Rezultati su pokazali da jedinke krumpirove zlatice iz središnje Hrvatske imaju širi oblik krila dok iz sjeverne Hrvatske imaju izduženi oblik krila. Izduženija su krila su aerodinamičnija te nam ovi rezultati govore da su jedinke iz sjeverne Hrvatske najsposobnije za daleke letove i širenje na nova područja.
Glavni rezultati disertacije pokazali su da se kombinacijom genetskih (SNP) metoda i geometrijske morfometrije mogu detektirati promjene pomoću koji možemo razlikovati rezistentne i nerezistentne populacije. Provedenim istraživanjem utvrđene su iste karakteristike populacija genotipizacijom uzoraka primjenom SNP markera i korištenjem tehnika geometrijske morfometrije. Također, rezultati su pokazali da rezistentne populacije imaju različite oblike krila ovisno o tipu rezistentnosti (kukuruzna zlatica). Ovaj rezultat posebno je važan jer pokazuje da različiti okolišni uvjeti poput insekticidnih tretmana, različito djeluju na promjene u obliku krila. Kako je oblik krila pod utjecajem genetskih čimbenika, a svaka genetska promjena je rezultat mutacije, naši rezultati upućuju na promjene povezane s razvojem rezistentnosti.
Bez praćenja učinkovitosti pojedinih mjera zaštite te provođenja ranih mjera detekcije velika je opasnost da će se rezistentne populacije širiti te će njihovo suzbijanje biti otežano. Ovaj pristup nudi novi uvid u važno područje suzbijanja štetnika – o tome kako spriječiti ili odgoditi razvoj rezistentnosti i smanjiti njene negativne učinke. Praktična primjena istraživanja podrazumijeva implementaciju testiranih metoda (genetska SNPs analiza i geometrijska morfometrija) za brzu detekciju rezistentnosti. Rana detekcija rezistentnosti od iznimnoga je značaja za hrvatsku poljoprivredu i stručnjake koji se bave zaštitom bilja jer takve metode, odnosno takvi testovi, ne postoje. Istraživanje je rezultiralo podacima važnim na nacionalnoj i međunarodnoj razini. Ovim istraživanjem dokazana je učinkovitost obiju testiranih metoda u otkrivanju promjena koje bi mogle biti posljedica razvoja rezistentnosti, što u praksi omogućuje pravovremenu reakciju proizvođača s jedne strane i zakonodavstva s druge. |
